基于濾膜上細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法的細(xì)菌總數(shù)快速檢測
【摘要】 細(xì)菌總數(shù)快速檢測在質(zhì)量監(jiān)測中具有重要的意義，目前除了經(jīng)典的平板培養(yǎng)法以外，還有微菌落法、阻抗法等快速檢測方法，這些方法或者需要較長的檢測時(shí)間，或者需要較高的檢測成本。本研究提出一種不需要培養(yǎng)而在濾膜上直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)的快速檢測方法，它主要分為過濾、染色、顯微鏡計(jì)數(shù)和計(jì)算四個(gè)步驟。計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí)，根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn)，對傳統(tǒng)公式進(jìn)行改進(jìn)，提出按區(qū)域計(jì)算細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算方法，提高了檢測精度。研究結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一種低成本、快速的細(xì)菌總數(shù)檢測方法。
1 引 言
細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)的研究已有很多，目前國標(biāo)規(guī)定的方法為平板計(jì)數(shù)法，該方法是將樣品加入瓊脂營養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。這種方法精度高，但耗時(shí)長，難以滿足實(shí)際工作需要。為了簡化檢測程序、縮短檢測時(shí)間，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的快速檢測方法的研究，提出了阻抗檢測法〔1〕、Simplate TM全平器計(jì)數(shù)法〔2〕、微菌落技術(shù)〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢測方法，取得了的成果，但檢測時(shí)間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎(chǔ)上，提出了在濾膜上染色后，直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)檢測方法，具體步驟為：用集菌儀進(jìn)行細(xì)菌收集→在膜上進(jìn)行染色→在油鏡下計(jì)數(shù)→按公式計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異，檢測時(shí)間約1 h，是一種快速的細(xì)菌總數(shù)檢測方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗(yàn)材料有集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），染色劑，生物顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司），聚碳酸脂膜（直徑47 mm）。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 準(zhǔn)備工作 卸下集菌儀的濾網(wǎng)（見圖1），統(tǒng)計(jì)濾網(wǎng)上小孔總數(shù)，為計(jì)算菌液濃度做準(zhǔn)備。另外，還需對集菌儀中的集菌器進(jìn)行高壓滅菌，以防止過濾過程中引入外源細(xì)菌。
2.2.2 細(xì)菌收集 取濃度的霉菌菌液300～500 ml，裝在集菌儀上，集菌儀采用蠕動(dòng)加壓方式對菌液施加的壓力，使菌液流過孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過濾方法是因?yàn)樗梢允辜?xì)菌相對均勻地分布在濾膜上，而選用聚碳酸脂膜是因?yàn)檫@種膜具有良好的透光性，便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜，切下一部分放在載玻片上，進(jìn)行染色、固定。染色的目的是增大細(xì)菌與背景的對比度，便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計(jì)數(shù)與計(jì)算 菌液經(jīng)集菌儀過濾后，細(xì)菌在濾膜上的分布見圖2、圖3，由圖可以看出細(xì)菌分布具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：一是細(xì)菌集中在一個(gè)個(gè)的圓形區(qū)域內(nèi)，這些圓形區(qū)域和擋板的小孔相對應(yīng)；二是各個(gè)圓形區(qū)域之間細(xì)菌很少。根據(jù)膜上細(xì)菌分布的這種特點(diǎn)，提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)出圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出菌液中細(xì)菌總數(shù)。具體步驟如下：隨機(jī)選擇10個(gè)圓形區(qū)域，在油鏡下，調(diào)節(jié)焦距以獲得較清晰的圖像（見圖4），統(tǒng)計(jì)每個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)的細(xì)菌個(gè)數(shù)，然后按公式(1)計(jì)算出菌液的濃度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細(xì)菌的區(qū)域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細(xì)菌的區(qū)域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細(xì)菌染色后圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中：X表示待檢菌液濃度（CFU/ml）
A表示10個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌總數(shù)
N表示濾網(wǎng)上小孔總數(shù)
V表示集菌時(shí)所用待檢菌液體積（ml）
3 結(jié)果與討論
3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
按上述方法計(jì)算得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法得到的結(jié)果見表1。表1 兩種方法得到的細(xì)菌總數(shù)
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6染色鏡檢
(cfu/ml）185168157165171166平板培養(yǎng)
(cfu/ml)176155165158183152
對表1中兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，在α=0.05時(shí)，雙尾檢驗(yàn)結(jié)果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說明兩種方法得到的結(jié)果無顯著性差異。
3.2 討論
3.2.1 計(jì)算公式的改進(jìn) 用集菌儀對樣本菌液進(jìn)行過濾時(shí)，由于濾網(wǎng)擋板的作用，使得細(xì)菌不是均勻地分布在整個(gè)濾膜上，而是集中分布在濾網(wǎng)的小孔處，所以，計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí)，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分別為濾膜直徑和視野直徑），該公式是微菌落方法檢測細(xì)菌總數(shù)中的常用計(jì)算公式。在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)細(xì)菌分布的特點(diǎn)，提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝挥?jì)算細(xì)菌總數(shù)的思路，使計(jì)算結(jié)果更接近真實(shí)值，從而提高了檢測精度。
3.2.2 細(xì)菌大小的影響 細(xì)菌大小對本實(shí)驗(yàn)的影響主要體現(xiàn)在鏡檢時(shí)，如果細(xì)菌太小，顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)不能將細(xì)菌從背景中分辨出來，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不能分辨大腸桿菌和葡萄球菌，而較大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 檢測時(shí)間進(jìn)一步縮短 細(xì)菌總數(shù)的經(jīng)典檢測方法是平板培養(yǎng)法，得到的結(jié)果精度高，但是它所用時(shí)間長，為了縮短檢測時(shí)間，出現(xiàn)了微菌落法，將檢測時(shí)間縮短為4 h左右〔3-5〕。本研究不對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，而是在膜上染色后直接用顯微鏡計(jì)數(shù)，大限度地縮短了檢測時(shí)間，使整個(gè)檢測時(shí)間在1 h左右。
4 結(jié)論
本研究用集菌儀將菌液過濾后，取濾膜一部分進(jìn)行染色、制片，然后在油鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)菌個(gè)數(shù)。根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn)，提出將圓形區(qū)域作為統(tǒng)計(jì)單位，得到圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按照該方法得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法的結(jié)果無顯著性差異。與平板培養(yǎng)法和微菌落法相比，該方法不需要細(xì)菌培養(yǎng)，檢測時(shí)間只需要1 h左右，明顯縮短了檢測時(shí)間，是一種快速、有效的細(xì)菌總數(shù)檢測方法。
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